АНАЛИЗ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ, СОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫЕ БАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТЫ

Общая характеристика хроматографических методов анализа

В фармацевтической химии широкое распространение получили методы анализа, сочетающие в себе разделение и количественное определение веществ. В качестве одной из основных групп такого анализа можно выделить хроматографические методы.

Существует ряд определений сущности методов хроматографии. Рассмотрим основные из них.

Согласно определению международной комиссией ИЮПАК в 1993 г. хроматография представляет собой физический метод разделения, в котором разделяемые компоненты распределены между двумя фазами, одна из которых является неподвижной (стационарная или неподвижная фаза), в то время как другая (подвижная фаза) движется в определенном направлении [20]. Следует подчеркнуть, что это определение сводит хроматографию только к физическому методу разделения, а это сужает область ее применения.

Существует точка зрения, что термин «хроматография» имеет три смысла:

- наука о межмолекулярных взаимодействиях и переносе молекул или частиц в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз;

- процесс дифференцированного многократного перераспределения веществ или частиц между несмешивающимися и движущихся относительно друг друга фазами, приводящий к обособлению концентрационных зон индивидуальных компонентов исходных смесей этих веществ или частиц;

- метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различии в скоростях их перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз [24].

Хроматографический метод представляет собой метод разделения веществ, в основе которого лежит разница в коэффициентах распределения этих веществ между неподвижной и подвижной фазами [3].

В настоящее время, по оценкам специалистов хроматография представляет собой:

- самый распространенный и совершенный метод разделения лекарственных смесей;

- уникальный метод качественного и количественного анализа сложных многокомпонентных смесей [11,22,27].

В соответствии с ОФС.1.2.1.2.0001.15 «Хроматография» Государственной фармакопеи Российской Федерации XIII издания хроматографией называется метод разделения смесей веществ, основанный на их многократном перераспределении между двумя контактирующими фазами, одна из которых неподвижна, а другая имеет постоянное направление движения. По механизму, лежащему в основе разделения, различают адсорбционную, распределительную, ионообменную и другие виды хроматографии [7].

Говоря о количественном анализе, необходимо отметить, что в ГФ XIII издания закреплено применение в фармацевтическом анализе четырех основных методов расчета концентрации анализируемого вещества по хроматографическим данным, в том числе:

- метод нормирования (метод внутренней нормализации). Применение данного метода основано на предположении, что на хроматограмме зарегистрированы все вещества, входящие в состав анализируемой смеси, и что доля площади (высоты) каждого пика от суммы площадей (высот) всех пиков соответствует содержанию вещества в массовых процентах;

- метод внешнего стандарта. При применении метода концентрацию испытуемого вещества определяют путём сравнения сигнала (пика), полученного на хроматограммах испытуемого раствора, и сигнала (пика), полученного на хроматограммах раствора стандартного образца.

- метод внутреннего стандарта, который основан на введении в анализируемую смесь определенного количества стандартного вещества (внутренний стандарт);

- метод стандартных добавок.Основан на введении в анализируемую смесь известного количества определяемого вещества и сравнения сигналов, полученных для испытуемого раствора со стандартной добавкой и без добавки определяемого вещества [7].

Порядок проведения качественного и количественного хроматографического анализа закреплен ГФ XIII в статьях:

- ОФС.1.2.1.2.0002.15 «Хроматография на бумаге»;

- ОФС.1.2.1.2.0003.15 «Тонкослойная хроматография»;

- ОФС.1.2.1.2.0004.15 «Газовая хроматография»;

- ОФС.1.2.1.2.0005.15 «Высокоэффективная жидкостная хроматография»;

- ОФС.1.2.1.2.0006.15 «Сверхкритическая флюидная хроматография» [7].

Кратко охарактеризуем сущность этих методов.

Хроматография на бумаге - это хроматографический процесс, протекающий на листе фильтровальной бумаги при перемещении по ее капиллярам и поверхности подвижной фазы.

Тонкослойной хроматографией или хроматографией в тонком слое сорбента называется хроматографический процесс, протекающий при движении подвижной фазы в тонком слое сорбента, нанесенном на инертную твердую подложку (пластинку) из соответствующего материала - стекла, металла или полимера. Тонкослойная хроматография (ТСХ) может использоваться для анализа как однокомпонентных, так и многокомпонентных лекарственных средств. В последнем случае подбираются условия хроматографирования, обеспечивающие разделение компонентов смеси.

Газовая хроматография представляет собой метод разделения летучих соединений, основанный на различии в распределении компонентов анализируемой смеси в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз, где в качестве подвижной фазы выступает газ (газ-носитель), а в качестве неподвижной фазы - твердый сорбент или жидкость, нанесенная на твердый носитель или внутренние стенки колонки.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (жидкостная хроматография высокого давления) является методом колоночной хроматографии, в котором подвижной фазой служит жидкость, движущаяся через хроматографическую колонку, заполненную неподвижной фазой (сорбентом). Колонки для высокоэффективной жидкостной хроматографии характеризуются высоким гидравлическим сопротивлением на входе.

Сверхкритическая флюидная хроматография представляет собой хроматографический процесс, в котором в качестве подвижной фазы используется флюид. Cверхкритический флюид (флюид) - это вещество, находящееся при значениях температуры и давления выше критических. В этом состоянии (сверхкритическом флюидном) свойства вещества являются промежуточными между свойствами газа и жидкости [7].

Говоря о значимости хроматографических методов, специалисты отмечают, что хроматография применяется во всех цивилизованных странах мира в жизненно важных сферах деятельности человека - от исследований в космосе. За вклад хроматографических методов в научные исследования - контроль загрязнений окружающей среды, пищевых продуктов и лекарств - хроматографию отнесли к двадцати выдающимся открытиям двадцатого века. Отдельно отмечается, что метод ВЭЖХ способствовал прогрессу в биохимии, биологии, медицине, фармацевтике [30,31,34].

В литературе также подчеркивается, что метод жидкостной хроматографии применим для разделения значительно более широкого круга веществ, чем газовая хроматография, поскольку большая часть веществ не обладает летучестью, а многие вещества неустойчивы при высоких температурах. В жидкостной хроматографии разделение обычно происходит при комнатной температуре [33].

К числу наиболее востребованных методов в фармацевтическом анализе также относят метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) - важный аналитический, физико-химический и микропрепаративный метод, который отличается простотой, высокой экономичностью и универсальностью. Тонкослойная (планарная) хроматография - представляет собой оперативный метод хроматографии для анализа всех классов химических соединений, приобрела значение в качестве экспресс-метода анализа и широко используется в медицине и фармации [5,17].

2.2 Хроматографический анализ производных барбитуровой кислоты

В настоящее время в качестве методов хроматографического анализа производных барбитуровой кислоты наибольшее применение находят:

1. Тонкослойная хроматография (ТСХ).

2. Газожидкостная хроматография (ГЖХ).

3. Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [5,21,26,28].

Хроматография в тонком слое используется в качестве предварительного испытания на наличие производных барбитуровой кислоты. Они дают возможность разделить несколько 6aрбитуратов при их совместном присутствии и идентифицировать каждый барбитурат в случае комбинированного отравления. ТСХ позволяет также отделить барбитураты от их метаболитов и провести очистку полученного извлечения от балластных веществ.

На стартовую линию хроматографической пластинки «Силуфол» или «Сорбфил» наносят с помощью капилляров в виде точек стандартные (1 мг/мл) хлороформные растворы барбитуратов (барбитал, бармамил, фенобарбитал, этаминал, бензонал, бензобамил) и хлороформное извлечение. Пластинку хроматографируют в системе хлороформ - н-бутанол - 25% раствор аммиака в объемном соотношении 7:4:0,5. Длина пробега фронта растворителей 10 см.

Хроматография в тонком слое сорбента в частной системе растворителей проводится в присутствии «стандартов», в качестве которых используют спиртовые растворы барбитала. Идентифицируют барбитураты на хроматографической пластинке по месторасположению, окраске и значению Rf анализируемого вещества и «стандарта».

Приготовление стандартного раствора барбитуратов: точную навеску барбитурата (50 мг) помещают в мерную колбу на 1000 мл и растворяют ее в 100 мл фосфатного буфера (pH 7,4) при осторожном перемешивании, затем объем жидкости доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация барбитурата составляет 50 мкг/мл [1].

Хроматографирование ведут на пластинках с закрепленным слоем силикагеля в системах растворителей:

1) хлороформ-ацетон (9:1) - для разделения N - замещенных и 5 5-замещенных производных, система является общей в скрининге лекарственных веществ кислого и нейтрального характера.

2) толуол - ацетон - этанол - 25% раствор аммиака (45:45:7,5:2,5) (применяется в экспресс- анализе интоксикаций)

3) хлороформ - н-бутанол - 25% раствор аммиака (70:40:5) - в качестве частной системы для разделения 5,5 -замещенных барбитуратов.

Детектирование веществ на хроматограмме проводится двумя реагентами: дифенилкарбазоном (ДФК) и HgSО4. При этом в местах расположения барбитуратов возникают красно- или сине-фиолетовые пятна. Идентификация проводится по величине Rf (отношение длины пробега вещества к длине пробега растворителя). Хроматографирование ведут параллельно метчикам (А), в качестве которых используют хлороформные растворы барбитуратов с известной концентрацией [28].

Применение метчиков наряду с расчетом Rf обусловлено невоспроизводимостью Rf из-за трудности соблюдения стандартных условий при хроматографировании. Чувствительность реакции барбитуратов с ДФК и HgSО4 достигает 0,5 мкг, однако, она неспецифична, поэтому дальнейшее подтверждение присутствия барбитурата производится микрокристаллическими реакциями, исследованием в УФ-области спектра после элюирования вещества с пластинки подходящим растворителем (боратный буфер с рН=10).

Газовая хроматография в сочетании с масс-спектрометрией используется для обнаружения нанограммовых количеств барбитуратов и позволяет вести анализ на фоне эндогенных соединений, выделенных из исследуемого объекта. Для выделения барбитуратов из объекта после гидролиза используют жидкость-жидкостную или твердофазную экстракцию. Концентрирование извлечений проводят упариванием при температуре 40-60°С. Идентифицируют барбитураты по времени удерживания - для барбитала - 5,18 мин [21].

ГЖХ-определение производных барбитуровой кислоты проводят на жидких фазах типа SE-30 или OV-17. Используют ступенчатый температурный режим колонки 180°С; 200°С - для барбитала, барбамила, нембутала; 230°С - для фенобарбитала или другие варианты программирования. Температура испарителя - 250 С. Для подготовки пробы в образец вводят серную кислоту в дозе 0,25 моль, такой же объем очищенного хлороформа. Смесь центрифугируют при 8000 об./мин. На анализ отбирают 1-5 мкл хлороформного извлечения.

При применении ГЖХ-анализа для обнаружения барбитала используют индекс удерживания 1490, фенобарбитала - 1974.

ВЭЖХ при обнаружении барбитуратов применяется в токсикологическом анализе. Барбитураты извлекают из биологических объектов при рН=1-2 хлороформом, смесью хлороформ - изопропанол 9:1 или диэтиловым эфиром. Предварительно рекомендуется при анализе мочи провести кислотный гидролиз для разрушения метаболитов - глюкуронидов [12].

Для обнаружения с помощью ВЭЖХ рекомендованы следующие условия: хроматограф «Милихром», хроматографическая колонка (62x2 мм), заполненная обращенно-фазовым сорбентом «Сепарон» С,8 (5 мкм), подвижная фаза - смесь 0,05 М водного раствора гидрофосфата аммония и метанола (60:40), скорость элюирования равна 100 мкл) мин. Сухой остаток растворяют в 100 мкл подвижной фазы и вводят в хроматограф 4 мкл.

Для обнаружения барбитуратов в исследуемой пробе сравнивают время (объем) удерживания и коэффициент емкости определяемого вещества с образцом сравнения в тех же условиях; сравнивают УФ-спектры поглощения с образцом сравнения, а также сопоставляют УФ-спектры исследуемого компонента и образца сравнения при 2 и более длинах волн и оценивают их спектральные отношения (табл. 4) [12].

Таблица 4 Хроматографические характеристики производных барбитуровой кислоты, полученные с помощью «Милихром А-02»

Сухой остаток, полученный при изолировании по методу В.А.Карташова и содержащий вещества кислотного характера, растворяют в небольшом объеме хлороформа и количественно наносят на стартовую линию хроматографической пластинки. По краям стартовой линии наносят хлороформные растворы «стандартов» (дифенин и тиопентал).

Условия анализа. Система растворителей: ацетон - н-гексан - диэтиламин (10:10:1). После высушивания пластинку обрабатывают раствором сульфата ртути. Вещества кислотного характера проявляются в виде полосы, а «стандарты» - в виде пятен белого цвета [16].

По полученным данным вещество относят к одной из трех хроматографических групп (табл. 5).

Таблица 5 Хроматографические группы веществ кислотного характера (производные барбитуровой кислоты)